ДЕТСКИЙ ВРАЧ        19 марта 2018        108         0

Линейный отбор в эмбриогенезе

Так как эмбриональные стволовые клетки экспрессируют гены, характерные для клеток примитивной эк­тодермы, они все чаще используются для исследования отбора исходных линий на ранней стадии развития. Эмбриональные стволовые клетки были предложены как мо­дель системы млекопитающих для этих целей, так же как земноводные успешно используются для изучения нейральной индукции.

Эмбриональные стволовые клетки были трансфецированы для экспрессии ранней ДНК для ноггина и хордина или были подвергнуты воз­действию рекомбинантного белка ноггина или хордина мыши. Экспрессия этих секретируемых сигнальных молекул самими эмбриональные стволовые клетки была наиболее эффективной в направлении их в сторону невральной дифференцировки (более 90% эмбриональных стволовых клеток, транс­формируемых pCS2-HornnioM, приобретали примитивный невральный фенотип даже после коротких периодов культивации). При этом гены маркеров стволовых клеток быстро регулируются на понижение, а гены паннейроэпителиальных и нейродетерминантных маркеров — на повышение.


style="display:block"
data-ad-client="ca-pub-2771990057543993"
data-ad-slot="4162906259"
data-ad-format="auto">

Воздействие рекомбинантными белками человека было менее эффективным в стимуляции нейронной дифференцировки, что может быть связано с удивитель­но низкой гомологией между белками человека и мыши или количеством белка, присутствующего в этих культурах. Во всех случаях добавление ВМР4 (Bone morphogenetic protein) — внеклеточной мишени этих белков — эффективно угне­тало нейронную дифференцировку с формированием эктодермоподобных клеток. То, что этот путь сигнализации функционирует в эмбриональные стволовые клетки, как и у земноводных, ясно из дифференцировки эмбриональные стволовые клетки с делецией генов, например, Smad4 — нулевые клет­ки (Smad переносят ингибирующий сигнал BMP в ядро). Они дифференциру­ются, в основном, в нейральные клетки. В интегрин-нулевых клетках сниже­ние экспрессии ВМР4 было причиной широкой дифференцировки нейронов из β1-нулевых клеток.

Эндодерма. Эндодерма (villin+, GATA-4+) висцеральная, а иногда и парие­тальная — быстро формируется в суспензионной культуре для покрытия скопив­шихся клеток. Некоторые маркеры ранней и средней дифференцировки (β-фетопротеин, альбумин) экспрессируются в этих культурах. Однако больше иденти­фицировалось дифференцированных эндодермальных производных.

Недавно несколькими группами ученых доказано, что эмбриональные стволовые клетки вырабатывают ин­сулин после продолжительного времени пребывания In vitro. Причем этой способ­ностью обладали как эмбриональные стволовые клетки человека, так и мыши. Soria et al. (2000) ввели в эмбриональные стволовые клетки мыши промотор гена инсулина человека, запускающего экспрессию гена гигромицина, затем селектировали клетки в антибиотике. После образования эмбриональных телец клетки диссоциировали, повторно суспензировали и дифференцировали в присутствии никотинамида и высокого содержания глюкозы. Затем кластеры клеток имплан­тировали в селезенку мышей-диабетиков. Такие животные скорректировали ги­пергликемию, вызванную стрептозотоцином, и восстанавливали вес тела без об­разования опухолей в течение 16 недель.

Lumelskey et al (2001) применяли метод с пятью этапами агрегации, отбора пе­ктинов, сопровождаемого экспансией фактора роста (FGF-2) с добавлением нико­тинамида, затем дифференцировкой. Эти клетки высвобождали инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой и соединялись с нейронными клетками в кластеры, подобные островкам In vitro. Однако секреция инсулина этими клетками была низ­кой по сравнению с β-клетками. При имплантации крысам с диабетом, вызванным стрептозотоцином, эмбриональные стволовые клетки-производные островки не способны были снимать инду­цированную гипергликемию, хотя имплантаты были васкуляризированы, а такие животные жили дольше, чем контрольные.

Недавно были получены также гепатоциты из эмбриональных стволовых клеток методом выращивания 18-дневной культуры, в которой эмбриональные стволовые клетки скапливались, а затем подвергались дей­ствию кислого FGF (созревание печени — 3 дня), фактора роста гепатоцитов (сред­ний этап — 7 дней) с последующей поздней стадией созревания, стимулирован­ной 4-дневным ростом в онкостатине Mt, дексаметазоне, с инсулином, трансферрином и селеном. Хотя эти исследования и показали, что эмбриональные стволовые клетки могут экспрессировать гены, типичные для дифференцированных гепатоцитов, нет доказательств, что гены маркеров эмбриональные стволовые клетки регулировались на понижение, как нет данных о присут­ствии в таких культурах других типов клеток.

Методом принудительной дифференцировки для активации дифференциров­ки гепатоцитов в эмбриональные стволовые клетки был сверхэкспрессирован фактор транскрипции HNF3 (подгруппы а, р). При дифференцировке в эмбриональных телец они оба вызывали экспрессию ге­нов обычно ранней, а не поздней эндодермы.

Мезодерма. Для получения клеток, формирующих кости из эмбриональных стволовых клеток, в эмбриональные тельца вноси­ли ряд «остеогенных» добавок, включая аскорбиновую кислоту, β-глицерофосфат, ВМР-2 и компактен, которые увеличивали количество сформированных костных узелков по сравнению с необработанными клетками эмбриональных телец. В другом исследовании был применен такой же набор факторов роста эмбриональные стволовые клетки, или их выращивали в куль­туре с мышиными остеобластами, что приводило к формированию костных узел­ков, которые экспрессировали коллаген типа I и остеокальцин. При добавлении в культуру через 14 дней после дифференцировки декаметазон, аскорбиновая кис­лота и β-глицерофосфат индуцировали пятикратное увеличение количества кост­ных узелков; в сокультуре с остеобластами — в 14 раз, по сравнению с необрабо­танными эмбриональные стволовые клетки.

Одна из основных целей исследований в области трансплантологии состоит в том, чтобы продуцировать ткани, которые адекватно иннервируются и васкуляризируются. Для достижения этой цели либо различные виды дифференцирован­ных клеток имплантируются вместе, либо незрелые клетки содифференцируются. Предполагается, что когда имплантируются несозревшие клетки, факторы ро­ста окружающей среды будут стимулировать дифференцировку в специфические для этой области, адекватные клетки, как это было определено для невральных стволовых клеток.

 

Для разработки функциональных двигательных групп в культурах висячей кап­ли эмбриональных стволовых клеток были совместно выведены клетки скелетной мускулатуры и нейроны с последующим выращиванием в культуре тканей в чашках Петри. Наблюдалась обширная колонизация кластеров рецепторами к никотиновым ацетилхолинам с агрином и синаптофизином (маркеры нейромытпечного соединения) в дифферен­цирующихся мышечных трубочках мускулатуры. Нервно-мышечные соединения формировались в близкой ассоциации с нейронными процессами и были функ­циональными по оценке фиксации бляшек.

Гемопоэтическая дифференцировка эмбриональных стволовых клеток, возможно, является четко определен­ной линией происхождения для образования из эмбриональные стволовые клетки. Дифференцировка в куль­туре метилцеллюлозы широко применялась для получения нейтрофилов, эритроцитов, тучных клеток и макрофагов из эмбриональные стволовые клетки. Перенос животным с наследственным дефицитом лимфоцитов показал способность их перестраивать популяции лимфо­цитов. Вопреки прежним исследованиям, установлено, что клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток, имеют многолинейный гемопоэтический реконституционный потенциал. Про­изводные от эмбриональных стволовых клеток широко использовались для расщепления каскадов экс­прессии генов и получения требуемых этим клеткам факторов роста, хотя сами эмбриональные стволовые клетки содержат РНК для многих известных кроветворных цитокинов.

Не так давно было доказано, что сверхэкспрессия гена LH2 гомеобокса LIM сти­мулирует самые ранние стадии гемопоэза; делеция гена маркера CD34 в эмбриональные стволовые клетки за­держивает коммитирование как эритроцитов, так и миелоцитов. Воздействие бел­ком Wnt3 приводило к увеличению количества эмбриональных телец, содержащих гемопоэтические очаги, что предполагает наличие новых сигнальных путей, которые могут быть во­влечены в раннюю сегрегацию кроветворных клеток-предшественников.

Эктодерма. Кератиноциты формируются в культурах интегрин-нулевых эмбриональных стволовых клеток. Базальные кератиноциты присутствуют в эмбриональных тельцах, развившихся в течении 20 дней в суспензии. Методом комбинирования кератин-специфический усилитель из гена ламинина 3а был лигирован вверх от промотора кератина 5 и TGFP. Та­кое образование было введено путем электрофореза в эмбриональные стволовые клетки. Были отобраны не­устойчивые клоны и клетки, дифференцированные как эмбриональные тельца, что приводило к фор­мированию очагов, содержащих меченые кератиноциты. Данный подход ускорит определение состояния культуры тканей и требований фактора роста для диф­ференцировки кератиноцитов с очевидными клиническими областями приме­нения.

Нейроны, подобно гемопоэтическим клеткам, легко дифференцируются из мышиных эмбриональных стволовых клеток. В большинстве исследований использовали этап 4-дневной агре­гации, сопровождаемый 4-дневным воздействием ретиноевой кислотой как агре­гатом (4- , 4+). В других исследованиях для дифференцировки использовали фак­тор роста, рост в клональных плотностях, культуру на поверхности стромальных клеток линии РА, для стимуляции нейронной дифференцировки. По­следующее измерение потенциалов действия, вызванных полученными клетками, подтверждало функциональность дифференцирующих нейронов. Нейроны GABA-ергического, дофаминергического, серотонинергического нейромедиаторных фенотипов были получены из эмбриональных стволовых клеток при использовании для стимуляции диф­ференцировки фактора роста.

С целью регуляции состояния культур и воздействия фактора роста для гене­рации нейронных клеток из эмбриональных стволовых клеток McKay et al. (2000) составили характеристику нейронов из области ромбовидной ямки (серотонинергические) и среднего мозга (дофаминергические). После агрегации эмбриональных стволовых клеток были отобраны клетки-предшествен­ники (нестин+) путем выращивания в определенной среде (отбор линии проис­хождения), увеличения содержания клеток-предшественников, с использованием FGF-2. Их подвергли действию FGF-8B (одного или в сочетании с белком Shh), основываясь на картине экспрессии этих сигнальных молекул в развивающемся мозгу, и аскорбиновой кислоты. При использовании этого метода культи­вирования, более чем 71,9% Дифференцированных клеток окрашивались антите­лами к нейронному тубулину, TUJ1. Добавление аскорбиновой кислоты, Shh и FGF-8B увеличило количество дофаминергических нейронов до 33,9% От всех нейронов или до 20% От общего количества клеток в культурах. При нормальных условиях культивирования 0,8% Полученных нейронов экспрессируют серотонин. Под воздействием Shh (с FGF-8B или без него) количество таких клеток увели­чивалось в 14 раз.

Эти методы не позволяют определить остающиеся виды клеток, так как авто­ры определяют данные RT-PCR, чтобы показать экспрессию генов-мишеней, а не маркеров стволовых клеток или маркеров других фенотипов. Указанные иссле­дования интересны тем, что в них объединены RT-PCR и анализ гибридизации In situ, что позволяет установить процент и местоположение дифференцированных нейронов.

Renonconrt et al. (1998) показали, что обработка эмбриональных телец ретиноевой кислотой при­водит к образованию нестин+ клеток-предшественников в центре скопления, а так­же нейронов, типичных для поджелудочковой зоны центральной нервной системы, включая как мотоней­роны, так и интернейроны.


Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Поиск по сайту
Поделиться
Свежие комментарии
Реклама