ДЕТСКИЙ ВРАЧ        19 марта 2018        285         0

Линейный отбор в эмбриогенезе

Так как эмбриональные стволовые клетки экспрессируют гены, характерные для клеток примитивной эк­тодермы, они все чаще используются для исследования отбора исходных линий на ранней стадии развития. Эмбриональные стволовые клетки были предложены как мо­дель системы млекопитающих для этих целей, так же как земноводные успешно используются для изучения нейральной индукции.

Эмбриональные стволовые клетки были трансфецированы для экспрессии ранней ДНК для ноггина и хордина или были подвергнуты воз­действию рекомбинантного белка ноггина или хордина мыши. Экспрессия этих секретируемых сигнальных молекул самими эмбриональные стволовые клетки была наиболее эффективной в направлении их в сторону невральной дифференцировки (более 90% эмбриональных стволовых клеток, транс­формируемых pCS2-HornnioM, приобретали примитивный невральный фенотип даже после коротких периодов культивации). При этом гены маркеров стволовых клеток быстро регулируются на понижение, а гены паннейроэпителиальных и нейродетерминантных маркеров — на повышение.


style="display:block"
data-ad-client="ca-pub-2771990057543993"
data-ad-slot="4162906259"
data-ad-format="auto">

Эмбриональные стволовые клетки

Воздействие рекомбинантными белками человека было менее эффективным в стимуляции нейронной дифференцировки, что может быть связано с удивитель­но низкой гомологией между белками человека и мыши или количеством белка, присутствующего в этих культурах. Во всех случаях добавление ВМР4 (Bone morphogenetic protein) — внеклеточной мишени этих белков — эффективно угне­тало нейронную дифференцировку с формированием эктодермоподобных клеток. То, что этот путь сигнализации функционирует в эмбриональные стволовые клетки, как и у земноводных, ясно из дифференцировки эмбриональные стволовые клетки с делецией генов, например, Smad4 — нулевые клет­ки (Smad переносят ингибирующий сигнал BMP в ядро). Они дифференциру­ются, в основном, в нейральные клетки. В интегрин-нулевых клетках сниже­ние экспрессии ВМР4 было причиной широкой дифференцировки нейронов из β1-нулевых клеток.

Эндодерма (villin+, GATA-4+) висцеральная, а иногда и парие­тальная — быстро формируется в суспензионной культуре для покрытия скопив­шихся клеток. Некоторые маркеры ранней и средней дифференцировки (β-фетопротеин, альбумин) экспрессируются в этих культурах. Однако больше иденти­фицировалось дифференцированных эндодермальных производных.

Эндодерма

Недавно несколькими группами ученых доказано, что эмбриональные стволовые клетки вырабатывают ин­сулин после продолжительного времени пребывания In vitro. Причем этой способ­ностью обладали как эмбриональные стволовые клетки человека, так и мыши. Soria et al. (2000) ввели в эмбриональные стволовые клетки мыши промотор гена инсулина человека, запускающего экспрессию гена гигромицина, затем селектировали клетки в антибиотике. После образования эмбриональных телец клетки диссоциировали, повторно суспензировали и дифференцировали в присутствии никотинамида и высокого содержания глюкозы. Затем кластеры клеток имплан­тировали в селезенку мышей-диабетиков. Такие животные скорректировали ги­пергликемию, вызванную стрептозотоцином, и восстанавливали вес тела без об­разования опухолей в течение 16 недель.

Lumelskey et al (2001) применяли метод с пятью этапами агрегации, отбора пе­ктинов, сопровождаемого экспансией фактора роста (FGF-2) с добавлением нико­тинамида, затем дифференцировкой. Эти клетки высвобождали инсулин в ответ на стимуляцию глюкозой и соединялись с нейронными клетками в кластеры, подобные островкам In vitro. Однако секреция инсулина этими клетками была низ­кой по сравнению с β-клетками. При имплантации крысам с диабетом, вызванным стрептозотоцином, эмбриональные стволовые клетки-производные островки не способны были снимать инду­цированную гипергликемию, хотя имплантаты были васкуляризированы, а такие животные жили дольше, чем контрольные.

Недавно были получены также гепатоциты из эмбриональных стволовых клеток методом выращивания 18-дневной культуры, в которой эмбриональные стволовые клетки скапливались, а затем подвергались дей­ствию кислого FGF (созревание печени — 3 дня), фактора роста гепатоцитов (сред­ний этап — 7 дней) с последующей поздней стадией созревания, стимулирован­ной 4-дневным ростом в онкостатине Mt, дексаметазоне, с инсулином, трансферрином и селеном. Хотя эти исследования и показали, что эмбриональные стволовые клетки могут экспрессировать гены, типичные для дифференцированных гепатоцитов, нет доказательств, что гены маркеров эмбриональные стволовые клетки регулировались на понижение, как нет данных о присут­ствии в таких культурах других типов клеток.

Методом принудительной дифференцировки для активации дифференциров­ки гепатоцитов в эмбриональные стволовые клетки был сверхэкспрессирован фактор транскрипции HNF3 (подгруппы а, р). При дифференцировке в эмбриональных телец они оба вызывали экспрессию ге­нов обычно ранней, а не поздней эндодермы.

Мезодерма

Мезодерма. Для получения клеток, формирующих кости из эмбриональных стволовых клеток, в эмбриональные тельца вноси­ли ряд «остеогенных» добавок, включая аскорбиновую кислоту, β-глицерофосфат, ВМР-2 и компактен, которые увеличивали количество сформированных костных узелков по сравнению с необработанными клетками эмбриональных телец. В другом исследовании был применен такой же набор факторов роста эмбриональные стволовые клетки, или их выращивали в куль­туре с мышиными остеобластами, что приводило к формированию костных узел­ков, которые экспрессировали коллаген типа I и остеокальцин. При добавлении в культуру через 14 дней после дифференцировки декаметазон, аскорбиновая кис­лота и β-глицерофосфат индуцировали пятикратное увеличение количества кост­ных узелков; в сокультуре с остеобластами — в 14 раз, по сравнению с необрабо­танными эмбриональные стволовые клетки.

Одна из основных целей исследований в области трансплантологии состоит в том, чтобы продуцировать ткани, которые адекватно иннервируются и васкуляризируются. Для достижения этой цели либо различные виды дифференцирован­ных клеток имплантируются вместе, либо незрелые клетки содифференцируются. Предполагается, что когда имплантируются несозревшие клетки, факторы ро­ста окружающей среды будут стимулировать дифференцировку в специфические для этой области, адекватные клетки, как это было определено для невральных стволовых клеток.

 

Для разработки функциональных двигательных групп в культурах висячей кап­ли эмбриональных стволовых клеток были совместно выведены клетки скелетной мускулатуры и нейроны с последующим выращиванием в культуре тканей в чашках Петри. Наблюдалась обширная колонизация кластеров рецепторами к никотиновым ацетилхолинам с агрином и синаптофизином (маркеры нейромытпечного соединения) в дифферен­цирующихся мышечных трубочках мускулатуры. Нервно-мышечные соединения формировались в близкой ассоциации с нейронными процессами и были функ­циональными по оценке фиксации бляшек.

Гемопоэтическая дифференцировка эмбриональных стволовых клеток, возможно, является четко определен­ной линией происхождения для образования из эмбриональные стволовые клетки. Дифференцировка в куль­туре метилцеллюлозы широко применялась для получения нейтрофилов, эритроцитов, тучных клеток и макрофагов из эмбриональные стволовые клетки. Перенос животным с наследственным дефицитом лимфоцитов показал способность их перестраивать популяции лимфо­цитов. Вопреки прежним исследованиям, установлено, что клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток, имеют многолинейный гемопоэтический реконституционный потенциал. Про­изводные от эмбриональных стволовых клеток широко использовались для расщепления каскадов экс­прессии генов и получения требуемых этим клеткам факторов роста, хотя сами эмбриональные стволовые клетки содержат РНК для многих известных кроветворных цитокинов.

Гемопоэтическая дифференцировка

Не так давно было доказано, что сверхэкспрессия гена LH2 гомеобокса LIM сти­мулирует самые ранние стадии гемопоэза; делеция гена маркера CD34 в эмбриональные стволовые клетки за­держивает коммитирование как эритроцитов, так и миелоцитов. Воздействие бел­ком Wnt3 приводило к увеличению количества эмбриональных телец, содержащих гемопоэтические очаги, что предполагает наличие новых сигнальных путей, которые могут быть во­влечены в раннюю сегрегацию кроветворных клеток-предшественников.

Эктодерма. Кератиноциты формируются в культурах интегрин-нулевых эмбриональных стволовых клеток. Базальные кератиноциты присутствуют в эмбриональных тельцах, развившихся в течении 20 дней в суспензии. Методом комбинирования кератин-специфический усилитель из гена ламинина 3а был лигирован вверх от промотора кератина 5 и TGFP. Та­кое образование было введено путем электрофореза в эмбриональные стволовые клетки. Были отобраны не­устойчивые клоны и клетки, дифференцированные как эмбриональные тельца, что приводило к фор­мированию очагов, содержащих меченые кератиноциты. Данный подход ускорит определение состояния культуры тканей и требований фактора роста для диф­ференцировки кератиноцитов с очевидными клиническими областями приме­нения.

Эктодерма

Нейроны, подобно гемопоэтическим клеткам, легко дифференцируются из мышиных эмбриональных стволовых клеток. В большинстве исследований использовали этап 4-дневной агре­гации, сопровождаемый 4-дневным воздействием ретиноевой кислотой как агре­гатом (4- , 4+). В других исследованиях для дифференцировки использовали фак­тор роста, рост в клональных плотностях, культуру на поверхности стромальных клеток линии РА, для стимуляции нейронной дифференцировки. По­следующее измерение потенциалов действия, вызванных полученными клетками, подтверждало функциональность дифференцирующих нейронов. Нейроны GABA-ергического, дофаминергического, серотонинергического нейромедиаторных фенотипов были получены из эмбриональных стволовых клеток при использовании для стимуляции диф­ференцировки фактора роста.

С целью регуляции состояния культур и воздействия фактора роста для гене­рации нейронных клеток из эмбриональных стволовых клеток McKay et al. (2000) составили характеристику нейронов из области ромбовидной ямки (серотонинергические) и среднего мозга (дофаминергические). После агрегации эмбриональных стволовых клеток были отобраны клетки-предшествен­ники (нестин+) путем выращивания в определенной среде (отбор линии проис­хождения), увеличения содержания клеток-предшественников, с использованием FGF-2. Их подвергли действию FGF-8B (одного или в сочетании с белком Shh), основываясь на картине экспрессии этих сигнальных молекул в развивающемся мозгу, и аскорбиновой кислоты. При использовании этого метода культи­вирования, более чем 71,9% Дифференцированных клеток окрашивались антите­лами к нейронному тубулину, TUJ1. Добавление аскорбиновой кислоты, Shh и FGF-8B увеличило количество дофаминергических нейронов до 33,9% От всех нейронов или до 20% От общего количества клеток в культурах. При нормальных условиях культивирования 0,8% Полученных нейронов экспрессируют серотонин. Под воздействием Shh (с FGF-8B или без него) количество таких клеток увели­чивалось в 14 раз.

Эти методы не позволяют определить остающиеся виды клеток, так как авто­ры определяют данные RT-PCR, чтобы показать экспрессию генов-мишеней, а не маркеров стволовых клеток или маркеров других фенотипов. Указанные иссле­дования интересны тем, что в них объединены RT-PCR и анализ гибридизации In situ, что позволяет установить процент и местоположение дифференцированных нейронов.

Renonconrt et al. (1998) показали, что обработка эмбриональных телец ретиноевой кислотой при­водит к образованию нестин+ клеток-предшественников в центре скопления, а так­же нейронов, типичных для поджелудочковой зоны центральной нервной системы, включая как мотоней­роны, так и интернейроны.


Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Поиск по сайту
Поделиться
Свежие комментарии
Реклама

Скрипт кэширования wordpress:0.3MB/0.00031 sec